科研丨西南大学: 食物-肠道-粪便循环中微生物转移对家蚕健康的影响(国人佳作)

  习惯性饮食改变后，身体往往会出现不适。我们以家蚕为模型，将其传统的桑叶饮食上的习惯改为人工饲料，发现家蚕在人工饲料下表现出更多的不适应现象，特别是疾病的发病率增加。

  改变饮食上的习惯可能会对健康产生负面影响。家蚕(Bombyx mori)是一种以桑叶为食的经济上重要的寡食性昆虫。在人工饲料条件下，蚕的生长发育和免疫抗病能力变弱。本研究以桑蚕为模型昆虫，探讨饮食变化与肠道微生物平衡之间的关系。结果发现，人工饲料降低了家蚕肠道细菌的多样性，使其肠道微生物结构变得简单。通过一系列分析食物、肠道和粪便微生物多样性之间的相关性，我们得知人工饲料更易发酵，并使得家蚕肠道中的乳酸菌富集，因此导致肠道酸化和微生物失衡。在与人工饲料结合时，条件致病菌Enterococcus mundtii可引起家蚕的生态失调，使家蚕频繁发生细菌性疾病。本研究为进一步研究饲粮环境变化与肠道微生物平衡的关系提供了技术参考。

  由于饲粮的不同，桑叶和人工饲料饲养的家蚕在生长发育(体重和龄期)和免疫抵抗力方面存在比较大差异，5龄时发病率约为32.3%，如果不采取其他治疗死亡率则为100%。研究者将与饮食密切相关的肠道微生物作为最初的研究重点。Chen等人的研究表明，微生物群落在前肠、中肠和后肠之间基本无法区分，因此，对饲喂桑叶(Mul组)和人工饲料(Art组)蚕(5龄)的全肠道进行16S rRNA基因测序。

  (a)试验组群落多样性Shannon指数和t检验的组间方差分析，***P 0.001。(b)不同样品中细菌门的相对丰度。(c)属水平饼图。(d)人工饲料组(Art：红色圆圈)和桑叶组(Mul：蓝色三角形)基于OTU水平微生物群落结构的PCA图。每个轴(PC1和PC2)解释的变异百分比是指由约束因子解释的总方差的百分比。群落变异基于Bray-Curtis距离和ANOSIM。(e)两组的ANOSIM分析。“Art to Mul”对应的框表示组间差异，其余框表示组内差异；Y轴刻度表示距离值。群落变异基于Bray-Curtis距离。(f)基于LEfSe的属水平物种差异分析。LDA阈值为2，其中在多个组存在差异的物种才被视为差异物种。

  在蚕的饲养过程中，发现一种症状一致的细菌疾病。起初尸体微微发黄；然后尾巴腐烂，身体缩短。死亡时腹部轻微肿胀，全身无力。

  对人工饲料饲喂的病蚕的肠道进行进一步分析。我们发现病蚕组的物种丰度和群落多样性显著低于健康蚕(图2a和b)。各组间优势属差异显著：健康组的优势属Ralstonia和Rhodococcus被病蚕组的优势属Enterococcus所取代，占比95%以上，其次为Weissella(图2c)。对食用桑叶的病蚕进行分析，也发现上述类似的症状。Mul_Sick组的优势属为肠球菌属(Enterococcus，(48.77%)，其次是乳杆菌属(Lactobacillus，(22.88%)和Weissella(10.82%)。

  此外，在人工饲料中添加了广谱兽药抗菌剂氟苯尼考(符号“+”，表示喂食含有抗生素的人工饲料的实验组)。相比于正常健康组，添加抗生素的健康蚕(+)的物种丰富度和群落多样性显著降低(图2a和b)，优势属间差异也显著。健康(+)组中，Weissella约占比40%，Enterococcus约占比30%，患病(+)组和患病组的微生物组成相同(图2c)。Venn图显示，患病(+)组无特有OTUs，所有健康蚕均有其OTUs(图2d)。分析群落结构发现，喂食人工饲料的病蚕均聚集在一起。在健康家蚕中，桑叶、人工饲料和添加抗生素的人工饲料之间存在显著差异(图2f)。物种相关网络图显示，在排名前30的优势种中，Enterococcus与其他22个属呈负相关，细菌属间无正相关关系(图2g)。因此，Enterococcus的增殖必然会抑制其他属，其他细菌也可能在一定程度上维持Enterococcus的丰度。Weissella和unclassified Lactobacillales相互促进，共同拮抗Halomonas、Cutibacterium和Bacillus。

  与人工饲料喂养的健康家蚕相比，患病家蚕的“磷酸转移酶系统(PTS)”和“淀粉和蔗糖代谢”通路的功能丰度更高(图S2b)。值得注意的是，在BugBase预测中，健康表型的蚕具有更高比例的“潜在致病性”类别。无抗生素组(健康组)主要由Ralstonia贡献，抗生素组[健康(＋)组]主要由Pseudomonas贡献(图S6e)。然而，肠球菌仅与“Mobile element containing”类别密切相关(图S6b)。

  试验组物种丰富度Chao1指数(a)和群落多样性Shannon指数(b)，组间方差分析采用t检验。柱状图上方的字母(a、b和c)表示在P0.05时存在显著差异。(c)不同样品中属水平的相对丰度。(d)三组在OTU水平的维恩图。(e)以桑叶为食的病蚕在属水平的饼图(Mul_Sick)。(f)基于OTU水平微生物群落结构的PCA图。Art_Healthy，喂食不添加抗生素人工饲料的健康蚕肠道(红色圆圈)；Mul_Healthy，喂食桑叶的健康蚕肠道(蓝色三角形)；Art_Healthy(+)，喂食添加抗生素人工饲料的健康蚕肠道(紫色十字)；Art_Sick，喂食不添加抗生素人工饲料的病蚕肠道(绿色钻石形)；Mul_Sick，喂食桑叶的病蚕肠道(黄色方块)；Art_Sick(+)，喂食添加抗生素人工饲料的病蚕肠道(红色三角)。群落变异基于Bray-Curtis距离和ANOSIM。(g)肠道细菌之间的网络相关性。环左侧的节点在所有实例中都呈正相关(红线)，蓝线表示属之间的负相关。

  高温蒸煮清除人工饲料中的细菌，但营养成分仍然丰富。然而，桑叶表皮提供的保护抵抗作用似乎不足。因此，细菌很容易在饲养(通过蚕的爬行)和储存过程中再次繁殖。因此，5龄蚕食用2天不含抗生素的人工饲料，剩下的食物指定为Co_Food，具有饲养过程(蚕爬行、粪便发酵)的痕迹，模拟养殖厂的实际生产活动。将不含抗生素的人工饲料放置在相同环境条件下2d，设定为Mono_Food组，无粪便或家蚕活动。

  与Mono_Food组相比，Co_Food组表现出更高的物种丰富度(图3a)和较低的群落多样性(图3b)。具体而言，与Mono_Food组相比，Lactobacillus和Weissella的相对丰度增加，Gluconobacter的相对丰度降低(图3c)。这表明，蚕的爬行和粪便丰富了饲料中的细菌，有利于乳酸菌(LAB)的繁殖，如Lactobacillus和Weissella。通过热图分析桑蚕肠道和不同食物中微生物的分布情况(图4)。与人工饲料相比，桑叶将更多的微生物引入桑蚕肠道中。同时，Lactobacillus、Gluconobacter、Enterococcus等微生物在人工饲料中大量存在，而在桑叶中却很少或完全不存在。

  物种丰富度Chao1指数(a)和群落多样性Shannon指数(b)以及组间方差分析采用t检验。ns，无显著差异。(c)不同样品属水平的相对丰度。Mono_Food：不含蚕或粪便的人工饲料，单独放置2天；Co_Food：人工饲料，与蚕和粪便一起放置2天，不含抗生素。

  Leaf_L1L3，适合1~3龄蚕生长的幼叶。Leaf_L4L5，适合4、5龄蚕生长的老桑叶。Art_gut，饲喂无抗生素人工饲料的健康蚕的肠道；Mul_gut，饲喂桑叶的健康蚕的肠道。

  对人工饲养饲养2d后的5龄蚕的肠道、粪便以及人工饲料进行16S rRNA基因分析。Venn图分析显示，三组共有39个OTUs，即39个OTUs贯穿食物-肠道-粪便循环(图6a)。食物组菌属数最少，以Lactobacillus和Weissella为主。粪便组和肠道组均富集Ralstonia、Rhodococcus和Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，此外，粪便组还富集Weissela、Lactobacillus和Bacillus(图6b)。共现网络分析显示，粪便和肠道组的关系更为密切，只有乳杆菌与所有组均相关(图6c)。三元相图显示不同组中优势菌种的组成和分布：Lactobacillus主要存在于食物组中，其他组中极少出现(图6d)，而Bacillus主要出现在粪便组。Weissella在食物组和粪便组间存在较小差异，约占50%；粪便组和肠道组均发现Ralstonia、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia和Rhodococcus，其中在肠道组中丰度较高，约为60-70%。LEfSe结果显示，各组间存在13个显著差异属(图6e)：食物组中有一个未分类属属于乳杆菌目，粪便组中有3个属，分别为Caulobacter、Lysinibacillus和Brachybacterium。KEGG功能预测分析，食物组中“氨基酸生物合成”“ABC转运蛋白”和“碳代谢”通路的富集程度低于肠道组和粪便组。

  由于LAB可能发挥重要作用，所以测量了各组的pH值。相比于喂食桑叶的蚕，喂食人工饲料的蚕肠液pH降低，且随着疾病的加重，pH下降更明显。在食物和粪便中，人工饲料的pH值低于桑叶。此外，饲喂人工饲料的家蚕粪便pH值低于饲喂桑叶的家蚕粪便pH值。

  (a)三组OTU水平的维恩图。(b)常见属的饼图。(c)基于OTU水平微生物群落结构的PCA图。每个轴(PC1和PC2)解释的变异百分比指由约束因子解释的总方差的百分比。群落变异基于Bray-Curtis距离和ANOSIM。

  (a)三组OTU水平的维恩图。(b)优势类群相对于处理的相对丰度的热图。层次聚类分析基于Bray-Curtis距离。(c)共 现 网络分析。节点表示物种或组，边表示组中包含的物种。物种节点越大，表示节点的中心性越高，节点在网络中的重要性越高。(d)三元相图。三个角代表三个组，图例颜色代表对应的门，圆圈代表门水平下的物种，圆圈的大小代表物种的平均相对丰度。(e)属水平上基于LEfSe的物种差异分析。

  用人工饲料代替桑叶喂蚕后，家蚕肠道微生物组的组成表现出较大的差别(图1)，构成微生物群的物种数量减少，结构单一。从生态学的角度来看，生物多样性的减少增加了破坏群落结构的可能性，从而增加了疾病传播的可能性。我们的研究表明，喂食人工饲料的蚕比喂食桑叶的蚕更易患细菌性疾病。一般来说，条件致病菌不会伤害其宿主，但是，当宿主的抵抗力较低，就会引起疾病。例如，Staphylococcus aureus可在人的鼻腔中定植，并在人与人之间传播但不会引起疾病，从而长期定植。喂食加抗生素的人工饲料的病蚕没有特有OTU，只有少数物种与健康家蚕共有(图2d)。通过微生物分析和接种实验，初步确定了Enterococcus与细菌性疾病的关系。Enterococcus可能是条件致病菌。在给予抗生素的健康家蚕的肠道中，Enterococcus仍占30%以上，其他属以LAB为主，与未给予抗生素的健康蚕属有显著差异(图2c)。婴儿时期使用抗生素会导致肠道微生物群失衡，即生态失调，可能导致各种疾病。添加抗生素后，家蚕肠道菌群结构发生显著变化：结构单一，Enterococcus增殖明显(图2)。即使不添加抗生素，喂食人工饲料的蚕也表现出与喂食桑叶的蚕相同的趋势(图1)。肠道中缺乏关键细菌会显著降低微生物多样性并导致生态失调，这为机会性肠球菌菌株致病创造了条件。

  不同于桑叶，人工饲料由于暴露在高温下没有原始菌群来源。然而，前三个优势属Ralstonia、Rhodococcus和Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia在两种饮食类型之间是相同的(图1c)，表明这些属的存在可能与宿主自身选择有关。此外，两组优势菌属相同可能是导致前20个KEGG途径没有显著差异的原因。Ralstonia为蚕的优势属，并与植物病害有关，这与本研究预测的“潜在致病性”途径的高贡献一致。因此推测，蚕是从宿主植物的叶面获得Ralstonia的。然而，本研究中，喂食人工饲料的蚕也富集Ralstonia，且相对丰度高于喂食桑叶的蚕。因此，植物叶片可能不是Ralstonia的主要来源，可能存在其他因素调节其与蚕的共生关系。

  Rhodococcus可生物降解乙酰胺杀虫剂，有利于家蚕解毒。某些Rhodococcus菌株产生独特的肽环，对Mycobacterium smegmatis表现出选择性活性并抑制Mycobacterium tuberculosis的生长。Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia包含许多有益的环境细菌物种，其中许多与植物(促进植物生长等)、重氮营养、生物修复和抗生素活性等有关。3个优势属在家蚕的肠道和粪便中明显多于食物(图6b)，这些属与“氨基酸的生物合成”“ABC转运蛋白”和“碳代谢”途径呈正相关。这些属的存在可能有助于蚕的解毒和生物修复，结果可为家蚕益生菌产品的开发提供参考。

  上述3个属在家蚕肠道中占据优势地位，在粪便中分布丰富(图6b)。然而，在病蚕和喂食添加抗生素的人工饲料的蚕中，它们减少到不及1%(图2c)。病蚕和喂食添加抗生素的人工饲料的蚕中主要细菌是Enterococcus、Weissella、Lactobacillus和其他LAB，它们广泛存在于粪便和食物样本中(图6b)。Weissella和Lactobacillus属于LAB，可以产生乳酸并促进植源性食物在动物肠道中的发酵，促进胃肠道的吸收。这些细菌通常用作发酵食品和动物饲料的益生菌，这与病蚕中“淀粉和蔗糖代谢”途径的升高这一现象一致。此外，其中一些物种充当机会性病原体，抗生素耐药性编码基因的存在可能会增加某些菌株的潜在致病性。本研究中，Weissella、Lactobacillus等LAB与健康状况呈负相关，与Enterococcus呈正相关(图2g)；它们的过度富集可能会改变肠道环境并促进Enterococcus的增殖，可通过抑制这些属的生长以调节肠道平衡。

  Enterococcus在BugBase表型预测中与“Mobile element containing”紧密关联，但它是引起各种疾病的重要病原体，具有很强的耐药性，可在恶劣条件下存活。在家蚕中，它通常是优势物种。E. mundtii已被确定为人工饲料饲养的桑蚕幼虫松弛症的病原。在本研究中，Enterococcus有四种不同的OUT；然而，只有OTU856在所有组中高度丰富，特别是在病蚕中。分离出的3株E. mundtii菌株均与OTU856匹配，接种后可致病，且致病能力不同。同一属的不同菌株之间也存在显著差异。16S rRNA基因测序区域很小，物种分类有限，菌株差异鉴定不足。因此，未来应将这些数据与宏基因组测序结合，以包含更全面的信息。

  本研究中，我们得知可能有两个因素影响家蚕肠道菌群的变化，包括喂养方式和食物本身的差异。早期的一项研究发现，桑叶可以提供更多的微生物来源，增加微生物肠道结构的复杂性和稳定性，并降低破坏的可能性。人工饲料是一种营养丰富的培养基，直接暴露在外部环境中。基于宿主的不同性质，吸引环境中的不同细菌。蚕的攀爬以及粪便共发酵导致人工饲料中Lactobacillus和Weissella等乳酸菌的富集，进而导致酸味释放并改变蚕的生存环境。

  优势菌丰度的变化需要我们来关注，因为它是肠道稳态不可或缺的调节因子，在很大程度上影响整个微生物群和肠道微环境的功能，包括酸积累和pH值的变化。家蚕肠道呈碱性，有利于形成合适的微生物群。然而，人工饲料比桑叶更偏酸性，提供酸性环境。此外，食物、肠道和粪便的pH值差异与LAB的富集一致，富含LAB的组分表现出较低的pH值。

  综上，我们初步提出食物-肠道-粪便微生物模型(图7)。首先，家蚕肠道中的优势菌属可通过排泄富集在粪便中。其次，人工饲料的宿主特异性使其无法富集这些优势属，但更适合乳酸菌等(图6b)。第三，这些LAB可以富集在粪便中，因为粪便的pH值降低(图6b)。第四，蚕的爬行和粪便的共发酵加速了人工饲料中LAB的富集，导致pH值降低。第五，蚕摄入人工饲料后，肠道pH值下降，改变了肠道环境，使Enterococcus和Weissella更易定植。最后，这些变化进一步累计导致肠道生态失衡，Enterococcus迅速增加(图2c)，进一步破坏肠道微生物稳态，损害宿主，引起疾病。

  及时清除粪便，更频繁地更换人工饲料，保持清洁的环境可以减缓肠道微生态失衡的过程，后续饲养确实有所改善，但疾病仍然比桑叶喂食更常见。桑蚕体内微生物的高度多样性和菌群的协同进化使其对桑叶营养的东西的适应性更强。饮食上的习惯的突然改变或蚕的简单微生物结构改变，例如改用人工饲料，会导致微生物失衡。未来能够最终靠添加关键目标细菌，并抑制过量LAB来调节平衡，也能够最终靠控制肠道环境来间接调节。人类在改变长期习惯性饮食后，也易患上肠胃不适等疾病。由于材料获取困难、获取周期长、研究难度大等原因，本研究可能为治疗人类胃肠道不适提供有价值的信息。

  习惯性饮食改变后，身体往往会出现不适。我们以家蚕为模型，将其传统的桑叶饮食上的习惯改为人工饲料，发现家蚕在人工饲料下表现出更多的不适应现象，特别是疾病的发病率增加。从微生物组的角度对喂食人工饲料的家蚕幼虫进行了系统研究，详细描述了人工饲料和桑叶饲料中肠道微生物的差异，并探讨其原因，获得的结果如下：(1)桑叶可提供更丰富的菌群，有助于维持肠道的稳定性，而人工饲料由于乳酸菌的积累使肠道微环境偏酸性，影响肠道微生物，进一步影响肠液的理化性质，导致营养吸收不良和免疫抵抗力下降。(2)在此过程中，粪便为人工饲料提供了丰富的乳酸菌，加速了其酸化过程。(3)初步针对人工饲料中常常会出现的细菌性疾病病原体，可为今后疾病防控提供指导。(4)对优势属及其分布进行了详细分析，筛选出一些可能调节肠道菌群平衡的关键属，为改进人工饲料养殖家蚕益生菌产品提供了思路。(5)最后，建立了食物-肠道-粪便微生物模型，为今后研究具有相似困难的不一样的物种提供参考。

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