显微镜下观察到感染ASFV GZ201801株的PAM出现细胞质空泡化和细胞尺寸缩小等严重的细胞病变(CPE)(图1A)。透射电子显微镜还显示，ASFV感染的PAM细胞体积缩小，细胞质密度和核膜密度增加，细胞膜形成囊泡，细胞膜结构完整(图1B)。用1MOI的ASFV感染PAM，并与2.5mM的z-VAD-FMK(泛半胱氨酸氨基转移酶抑制剂)、Belnacasan(半胱氨酸氨基转移酶-1选择性抑制剂)、Fec-statin-1(铁下垂抑制剂)和Necrostatin-1(细胞坏死抑制物)与ASFV组相比，所有药物处理的PAM的存活率均明显提高(图1G)，表明ASFV感染可通过多种方式诱导细胞死亡，包括细胞凋亡、下垂、铁下垂和细胞坏死。

  以往的研究表明，ASFV GZ201801株可诱导宿主细胞凋亡。因此，作者用Western blotting检测了裂解caspase3蛋白和促凋亡蛋白Bax的表达水平。与对照组相比，ASFV感染使这两种蛋白的表达水平升高。抗凋亡蛋白Bcl2和Bclxl的表达水平先上升后下降(图2A)。检测对照组和ASFV治疗组各时间点的细胞凋亡率，并计算其差值。流式细胞仪检测显示，与对照组相比，ASFV感染组早期细胞凋亡率呈下降趋势，晚期细胞呈上涨的趋势(图2B)。这些根据结果得出，ASFV在感染早期抑制细胞凋亡，在后期激活细胞凋亡。

  ASFV感染PAM 3、12和48h后，进行转录测序。分析根据结果得出，与对照组相比，感染3h后有1,775个上调基因和1,449个下调基因，12 h后有3,023个上调基因和2,657个下调基因，48 h后有2,087个上调基因和2,056个下调基因(图3A、C和E)。

  在感染后3、12、48h对上调的差异基因进行KEGG分析。感染后3h，差异表达基因在细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK-STAT信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、C型凝集素受体信号通路、IL-17信号通路、Toll样受体信号通路、HIF-1信号通路、Th17细胞分化、趋化因子信号通路、造血细胞谱系、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、Th1和Th2细胞分化、RIG-L样受体信号通路中显著丰富(图3B)。感染后12h，细胞因子-细胞因子受体相互作用、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路、C型凝集素受体信号通路和JAK-STAT信号通路均显著丰富(图3D)。感染后48h，DEGS在破骨细胞分化、剪接体、代谢途径、溶酶体、细胞凋亡、吞噬小体和C型凝集素受体信号通路中显著丰富(图3F)。

  这些根据结果得出，ASFV在感染早期激活JAK2-STAT3信号通路，在感染后期激活细胞凋亡通路。利用KEGG途径富集化分析网站分析JAK2-STAT3途径的相关因素。IL-6细胞因子被发现激活JAK2-STAT3途径，促进STAT3在细胞核中的磷酸化，上调下游蛋白Bcl2和Bclxl的表达，进而达到抗凋亡作用(图3G)。

  由于ASFV感染可诱导细胞凋亡，作者检测了感染后3、12、24、36和48h以及JAK2-STAT3途径抑制剂AG490和AND处理前后PAM中凋亡相关蛋白的表达。抑制JAK2-STAT3途径后，裂解的caspase3蛋白和促凋亡蛋白Bax的表达水平在ASFV感染的早期阶段增加。此外，抗凋亡蛋白Bc l-xl的表达水平降低(图5)。这些根据结果得出，抑制JAK2-STAT3通路可以显著促进ASFV诱导的PAM凋亡。

  为了确定与触发JAK2-STAT3途径有关的病毒包膜蛋白，将ASFV包膜蛋白p12、CD2v、p22、p54和p32在HEK293T细胞中过表达，并利用双荧光素酶报告系统筛选它们上调STAT3启动子的能力。在这些蛋白质中，CD2v显示了最大的作用(图7A)；因此，它被选择进行进一步的检测。免疫印迹法检测ASFV感染过程中P30和CD2v蛋白表达水平的变化。根据结果得出，PAM感染ASFV 3h后可检测到CD2v的表达，但表达水平低于P30(图7B)。在感染ASFV 12h的PAM中分析了内源性CD2v和STAT3蛋白，并在ASFV感染后用共聚焦显微镜观察到STAT3的核易位(图7C)。在PK-15细胞中，单独转染STAT3 36h后，STAT3定位于细胞质内。然而，当与ASFV CD2v共转染时，共聚焦显微镜下观察到36小时后STAT3蛋白发生显著的核易位(图7D)。这些根据结果得出，ASFV感染可以诱导STAT3的核易位，ASFV的CD2v蛋白促进STAT3的磷酸化并将其转位到细胞核内，从而触发JAK2-STAT3途径。

  在之前的研究中，作者进行了酵母双杂交试验，发现ASFV CD2v蛋白可与宿主蛋白CSF2RA相互作用，已知CSF2RA作为细胞因子受体激活JAK2-STAT3下游途径。因此，该文进一步研究了ASFV CD2v与CSF2RA的相互作用。用共聚焦显微镜观察到CD2v和CSF2RA在PK-15细胞中的共存(图9A)。

  此外，在HEK-293T细胞中进行了免疫共沉淀实验，以评估CD2v是否与CSF2RA复合体相互作用。如(图9B)所示，CSF2RA与CD2v共沉淀。为了进一步证明CSF2RA在CD2v调节JAK2-STAT3途径中的作用，作者在宿主细胞中用siRNA干扰CSF2RA蛋白(图9C)。经CSF2RA siRNA处理的ASF2RA感染细胞的Western印迹分析表明，抑制CSF2RA的表达降低了ASFV诱导的JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平，增加了裂解caspase3的表达，并抑制了早期感染过程中Bcl2的表达。同时，ASFV P30蛋白的表达受到抑制(图9D)。这些根据结果得出，CSF2RA与CD2v相互作用，激活JAK2-STAT3通路，在感染早期抑制ASFV诱导的细胞凋亡，从而维持病毒的复制。在CSF2RA的siRNA干扰后，ASFV感染早期激活的JAK2-STAT3通路可以下调，促进细胞凋亡，抑制病毒复制。为了进一步探讨CD2v如何与CSF2RA相互作用来调节JAK2-STAT3通路的激活，作者研究了CSF2RA与KAP1之间的相互作用。KAP1是STAT3的负转录调节因子，它的抑制能够在一定程度上促进STAT3的磷酸化进入细胞核。通过共聚焦显微镜和免疫共沉淀实验，作者发现CSF2RA与KAP1(图9E和图F)相互作用，表明ASFV激活PAM中的JAK2-STAT3途径是通过抑制KAP1促进STAT3磷酸化进入细胞核所致。

  目前，还没有商业化的抗ASFV疫苗或抗病毒药物。作者证明了ASFV通过JAK2-STAT3途径复制。更具体地说，ASFV CD2v与CSF2RA相互作用，激活JAK2-STAT3途径，抑制细胞凋亡，从而维持感染细胞的存活，促进病毒复制。该研究揭示了JAK2-STAT3途径在ASFV感染中的重要意义，并确定了CD2v进化为与CSF2RA相互作用并维持JAK2-STAT3途径激活以抑制细胞凋亡的新机制，从而阐明了ASFV对宿主细胞信号重新编辑的新发现。

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