本研究采用连续流反应器（CFR）和序批式反应器（SBR），研究了在降低温度和非严格厌氧条件下CFR和SBR厌氧氨氧化颗粒形成的差异。

  本研究采用连续流反应器（CFR）和序批式反应器（SBR），研究了在降低温度和非严格厌氧条件下CFR和SBR厌氧氨氧化颗粒形成的差异。根据结果得出，CFR和SBR在第70天都成功地实现了初始颗粒化（D[4，3] = 280.44和346.28 μm）。与SBR相比，当水温出现季节性下降（18-14℃）时，由于CFR具有较好的生物质保留能力（1397 mg L

  ）。因此，不同的操作导致了厌氧氨氧化颗粒化方法不一样。颗粒在CFR中的流变性能优于SBR。

  基于CFR提供的稳定适宜的环境，厌氧氨氧化细菌（AnAOB）能够容易地自聚集并分泌胞外聚合物（EPS），EPS可以捕获其他细菌作为守护者。在SBR中，AnAOB在其他细菌和厚

  EPS的保护下，生活在棕褐色颗粒内部，其它聚集物附着在固体载体表明产生生物膜。

  译名：在降温和非严格厌氧条件下厌氧氨氧化菌在厌氧氨氧化颗粒中的富集：连续和顺序分批补料策略的比较

  两个反应器连续运行390天。图1为CFR和SBR在整个运行周期的脱氮性能。在NLR与SBR（0.04

  26天达到71.03%左右。而SBR在第26天的TN去除率为33.29%。在第26天，CFR的ΔNO

  -N比值稳定，接近理论值，SBR在第199天接近理论值。CFR和SBR的NRR值分别约为0.57和0.15 kg N m

  。需要注意的是，与SBR相比，低温对CFR脱氮的影响较小。从第159天到第181天，温度从18℃下降到14℃，CFR和

  的NRR值都显著下降（分别为0.34-0.19和0.07-0.02 kg N m

  -N的去除效率也显著下降（CFR：97.91-61.70%和90.80-61.47%；SBR：60.42-28.72%和98.47-51.95%）。然而，如图4所示，在运行时间的159天至181天之间，MLSS在CFR中的浓度明显高于SBR

   0.01）。因此，脱氮效率的差异是由生物量浓度引起的。不出所料，从第148天到第214天，SBR的沉淀物被洗出，这在3.1.3节中得到了进一步证实。

  在350-390天期间，CFR和SBR平均NLR分别为0.77（±0.04）和0.17（±0.01）kg N m

  如图2所示，两种反应器的颗粒形态差异很大。在第42天，SBR慢慢的出现一些小颗粒（图2b和l），但与CFR相比，SBR中出现了更多的无定形絮凝物。“颗粒沉淀物被定义为最小尺寸为200 μm的微生物聚集体”为标准，以区分颗粒和絮凝生物量。在第70天，CFR可称完全颗粒化，平均颗粒体积直径（D[4，3]）为280.44 μm（图3）。SBR沉淀物粒径（346.28 μm）高于CFR沉淀物粒径（

  为了揭示SBR和CFR厌氧氨氧化颗粒化差异巨大的原因，在第107天进行了SBR和CFR的循环试验（CFR中的水在一个循环试验前先排出，下一个循环试验与SBR相同）（图S2）。首先，两个反应器中的DO浓度比合成废水中的自来水高5-6

  ）下存活。因此，在每个循环的进料阶段开始时较高的DO水平可能会引起SBR中厌氧氨氧化颗粒化的困难。而CFR持续低DO浓度（0.12-0.18

  ），这与之前的研究相似。在循环试验中，还对ORP这一重要的工艺指标参数进行了监测。ORP根据结果得出，厌氧氨氧化工艺的脱氮限制在较低的ORP值范围内（−18-+56 mV），这与前人的研究结果相似。

  在CFR处理中，103-366天厌氧氨氧化颗粒以“铁红花椰菜”为主。还有一些颗粒是半透明的，甚至是空心的，就像我们之前研究的那样。最终平均直径约为1 mm，这与之前的研究一致。在SBR中，颗粒形态与CFR并不相似。如图2n所示，由于好氧菌在反应器中消耗了过量的DO，厌氧氨氧化聚集体倾向于生长在颗粒内部。因此，在循环试验的补料阶段开始时，如图2I和m所示的小型厌氧氨氧化聚集体暴露在较高水准（5-6

  （图4a和b）。这是可接受的，因为初步冲洗是颗粒化所固有的。20天后，CFR和SBR的MLSS分别增加到515 mg L

  。从第148天到第214天，在SBR中出现了了生物量流失（392-117mg L

  ），这可能是由于温度显著下降所致（图1）。然而，在第368天，随着温度上升到21℃，SBR的MLSS和MLVSS含量分别逐渐增加到520 mg L

  。因此，认为温度是SBR中生物量变化的根本原因是合理的。此外，温度对CFR和SBR影响的差异在4.2节中进一步讨论。

  以上，这表明颗粒有所消退。因此，与CFR相比，SBR的颗粒化延迟严重。

  由图4c和d可知，在第13-148天，CFR和SBR的PN和PS含量明显地增加（CFR：16.77-110.80 mg g

  ）。第148-262天，CFR和SBR的PN和PS含量下降（CFR：110.80-37.89 mg g

   0.05）。EPS是微生物分泌的，有利于微生物在各种各样的环境下的生存。第103-148天，温度从26℃降至19℃，随着EPS含量的增加，温度呈下降趋势。同时，EPS含量的降低表明AnAOB的生活环境得到了改善，即183-262天的温度从14℃上升到21℃（

   0.05）。关于降低温度对CFR和SBR的EPS影响的差异在4.2节中进一步讨论。然而，如图4所示，在159-181天，CFR中的MLSS浓度明显高于SBR。因此，可以合理地认为，脱氮效率的差异是由MLSS浓度引起的。

  如前期研究所述，PN越高，颗粒的疏水性越好，颗粒的沉降能力和稳定能力越好。CFR的PN含量高于SBR，表现出更好的形态特征，如图2所示。微生物大量产生EPS，有利于其在各种生活环境中生存。EPS含量的降低表明厌氧氨氧化细菌对生存环境的逐渐适应。此外，EPS的PN/PS比被认为是沉淀物稳定性的良好指标：PN/PS比越高，稳定性越差。第214天后，随着温度的升高，长时间运行的CFR和SBR反应器的EPS含量和PN/PS比逐渐降低，表明两个反应器的厌氧氨氧化颗粒性能逐渐改善。

  对于SAA，EPS与SAA之间有一定的关系。综上所述，CFR中SAA高于SBR，说明CFR中AnAOB的丰度较高（图8）。在两个反应器中，每克色氨酸或蛋白样物质的荧光强度显示出与PN相同的趋势（表1）。在第214天，CFR和SBR中色氨酸或蛋白样物质达到最大值，表明厌氧氨氧化生物量对低温胁迫（14℃）的保护响应。在第103天，在CFR中发现了可溶性微生物副产物样物质（图5），其颗粒显示出良好的形态特征（图2e）。然而，SBR中的可溶性微生物副产物在第368天出现，此时SBR中的厌氧氨氧化生物质似乎实现了良好的颗粒化（图2t）。

  采用FISH为基础的微生物分析技术观察第215天CFR和SBR的颗粒。如图6所示，AnAOB占来自CFR的颗粒中细菌总数的38.8%，占来自SBR的颗粒中细菌总数的5.6%。CFR制得的颗粒具有中空的空间和非光滑的内壁，有若干气孔，用于交换底物（NH

  ）。SBR的三个小颗粒（图6b）中，有两个是不规则的，另一个是空心的，这可以对应第257天的微观图片（图2）。为了研究CFR和SBR的微生物群落特征，对部分颗粒样本做16S核糖体RNA基因焦磷酸测序分析。保存种子颗粒并命名为SS；C1和C2的颗粒样品是在第170天和第400天从CFR中收集的；第170天和第400天来自SBR的颗粒样品命名为S1和S2-G。另外，从SBR内壁采集了一些生物膜样品，为S2-M（图7）。

  图6 第215天CFR和SBR颗粒的FISH图像（FITC标记的EUB338探针的绿色信号表示细菌总数，AMCA标记的Amx820探针的蓝色信号表示AnAOB，亮蓝色信号来自EUB338探针和Amx820探针结合的混合物）。

  Proteobacteria）（图8a）。目前报道的浮霉菌门具有厌氧氨氧化功能。变形菌门的存在表明该反应器存在反硝化作用，之前的研究发现，变形菌门可通过死细胞释放的EPS和有机物作为反硝化碳源。变形菌门由多种代谢类型的好氧、厌氧或兼性细菌组成，在一些废污水处理过程中也被证实SS、C1、S1、C2、S2-G和S2-M分别占26.87、20.91、31.63、29.51、35.17和66.16%。此外，拟杆菌门（Bacteroidetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflex）和放线菌门（Actinobacteria）参与反硝化过程。图8b显示了微生物种群在纲水平上的分布。主要类别为浮霉菌纲（Planctomycetia）、鞘脂杆菌纲（Sphingobacteriia）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、酸杆菌_Gp4纲（Acidobacteria_Gp4）和γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）。

  （SS、C1、S1、C2、S2-G和S2-M分别占3.06、47.21、7.02、2.38、1.45和0.25%）。由于不严格的厌氧条件，发现了亚硝化螺菌属（

  ）被鉴定为异养硝化-好氧反硝化细菌（HNO-ADNB），广泛存在于生物膜（S2-M）中，占49.91%（SS、C1、S1、C2和S2-G中分别占0.15、0.10、0.20、0.74和9.69%）。此外，假单胞菌属（

  被鉴定为反硝化细菌（DNB），可能是利用EPS中的可溶性微生物副产物样物质去除氮。重要的是，在SS、C1、S1、C2、S2-G和S2-M中，

  （分别占8.83、0.43、1.86、0.03、0.07和0.02%）可以通过EPS分泌来加速AnAOB的聚集，在SS中很丰富。这表明

  可能是厌氧氨氧化颗粒早期颗粒化的贡献者。因此，厌氧氨氧化、HNO-ADNB和DNB的共存是厌氧氨氧化颗粒沉淀在没有严格厌氧条件下高效脱氮的保证。

  图8a–c为储能模量（G′）、损耗模量（G″）、复态粘度（η*）和剪切应力（τ）的应变（γ）相关性。三个厌氧氨氧化样品的G′、G″和η*在低应变（γ2%）下具有相对恒定的值，表明存在线性粘弹性（LVE）区域。线性粘弹性区域（LEVR）表示在不破坏样本结构的情况下可执行测试的范围。该区域位于图形的左侧，即低应变值的范围。LEVR中的G′和G″值可以表示样品的粘弹性行为。样品GG″具有凝胶状或固体状结构，可称为粘弹性固体材料。当G′G″时，样品具有流体结构，可以称为粘弹性流体。因此，三种厌氧氨氧化样品在较低的应变下表现出凝胶状或固体状的机械行为。这些流变特性意味着厌氧氨氧化样品是水凝胶，一种能够可逆地吸收和排出水或生物液体的凝胶。

  也称为流动应力，指的是G″=G′交点处的剪应力值。在较高的剪切下（ττ

  值分别为71.58、48.49和52.56。同时，CFR颗粒的G

  也显著高于SBR颗粒和SBR生物膜（分别为6567.4、2739.6和3808.4 Pa）。这表明CFR中颗粒的机械强度高于SBR中聚集体的机械强度（表3）。

  值差距较大（5.89）。因此，SBR中的聚集体比CFR中的颗粒更软，显示出更蓬松的结构和更低的EPS含量。

  结果表明，在42天时CFR和SBR处理出现了混有絮凝体的红色厌氧氨氧化聚集体。随着絮凝剂的不断洗涤，CFR在第70天首次出现了明显的颗粒。而在SBR中，随着单个红色聚集体的消失，难以颗粒化，而AnAOB更喜欢在拥有非常良好滞留能力的厌氧生物聚集体内部以小规模菌落生长。EPS在厌氧氨氧化颗粒的形成、稳定和生长中发挥着及其重要的作用。随着颗粒化过程的进行，EPS含量逐渐增加。第103天，CFR和SBR的颗粒尺寸分别为525.47和366.56 μm，PN含量分别为47.37和38.37 mg g

  VSS。SAA可以很好地揭示AnAOB的活性。如图3所示，与SBR相比，CFR的SAA值在第103天达到最大值，与第368天的SBR相比（CFR和SBR中的SAA值分别为0.763和0.278）。结合第192天的显微图像和第170天的高通量焦磷酸测序结果，发现CFR颗粒沉淀形态完美，AnAOB比例高。

  最重要的是，在颗粒化过程中，不同的操作模式（CFR和SBR）导致不同的颗粒特性。如图S2所示，SBR（好氧/缺氧）更加有助于部分自养细菌的繁殖，表现为棕褐色絮凝体，运行周期中早期需氧（DO：5-6

  ）由于氧扩散引起的中毒会抑制AnAOB的生长。而AnAOB在CFR中继续保持低氧（低DO浓度：0.12-0.18 mg L

  ），发挥氧解毒能力，这与之前的研究类似。因此推测，颗粒化初期的絮状活性沉淀物对消耗过量的DO非常重要。

  经过长时间运行，CFR和SBR的粒径分别为102.99 μm和1000.42 μm，MLVSS分别为3322 mg L

  。但在SBR中，大量的生物质附着在内壁或混合叶片的表面，形成致密的生物膜（图S3a-b）。同时，一些生物膜脱落并漂浮在水面上，这可能会引起流出物的堵塞（图S3c）。第400天的高通量焦磷酸测序结果显示，CFR和SBR的颗粒中

  的丰度为0.25。但生物膜中不动杆菌属的丰度较高（49.91%），可能具有极强的EPS分泌能力。作为流变特性分析，集料的机械强度按序为：SBR颗粒SBR生物膜CFR颗粒，表明CFR厌氧氨氧化颗粒结构稳定，如图FISH图（图6）所示。

  本研究没有对温度来控制，温度随季节变化（14-36℃）。如图1所示，在第57-159天，尽管温度从36℃下降到18℃，但CFR的

  。第159-181天，温度从18℃降至14℃，CFR和SBR的NRR均显著下降（分别为0.34-0.19和0.07-0.02

  ），表明降低18℃以上的温度对NRR的影响不大。但在18-14℃时，温度下降对反应器性能的不利影响是显著的。当温度稳定在14℃时，CFR的NRR从0.20逐渐增加到0.33

  ）。如图4所示，在148-214天，CFR中的MLSS浓度明显高于SBR。因此，认为脱氮效率的差异是由生物量浓度引起的是合理的。也就是说，CFR的NRR的提高可能是由于生物量的增加。与之前添加额外颗粒的研究不同，在本研究中，CFR通过自身生物量的增殖得到了慢慢的变多的沉淀颗粒。如图4所示，与SBR的MLVSS（181-92 mg L

  。因此，提高反应器自身生物量的能力能够保证低温NRR。低温可提高流体的粘度和密度。颗粒沉降速度随流体密度的增加而减小，这符合Stokes定律。Winkler等人观察到，当水的温度从40℃降至5℃时，相同颗粒的沉降速度降低了2倍。因此，流体密度的增加可能导致更高的生物量流失。与SBR相比，生物量在CFR中的保留能力更好，这是由于引入了底部流出物和生物量选择区，这在我们之前的研究中已有明确介绍。SBR采用沉降后出水的策略，导致生物量因沉淀性能恶化而被洗掉，即在214天，温度为14℃时，SVI

  值增至108.70。因此，SBR的MLSS非但没有明显地增加，反而持续下降。

  另一方面，随着温度的降低，CFR和SBR的SAA均显著下降（图4），这是由于

  的相对丰度降低（图8c）。总体上，CFR的NRR高于SBR，这与CFR的生长生物量一致。

  如图9所示，结果显示了在无严格厌氧条件下，CFR和SBR中AnAOB的颗粒化情况。在进行

  和SBR的初步冲洗之前，絮凝活性沉淀物中出现了厌氧氨氧化聚集体。这一阶段称为厌氧氨氧化预颗粒化，是厌氧氨氧化初始富集的关键时期。絮凝活性沉淀物起着保护作用，保护AnAOB免受氧等有毒物质的侵害。随着絮凝体的洗涤，颗粒化过程在CFR和SBR中变得不同。

  在CFR中，稳定的营养供应、水力剪切力和持续的低DO浓缩提供了一个稳定适宜的环境，能更好地满足AnAOB较窄的生态位。因此，AnAOB容易自聚集并分泌EPS，EPS可以捕获其他细菌作为守护者。因此，厌氧氨氧化颗粒过程是顺利的。在SBR中，剩余的絮凝活性沉淀物不能在每个循环开始时随意消耗高浓度的DO，这是顺序分批给料间接引起的。AnAOB一旦直接暴露在高DO的状态下，就很难快速富集。然而，在大的絮凝活性沉淀物的聚集体中观察到红色厌氧氨氧化絮凝体，也符合AnAOB的生态位。长时间运行过程中，在其他细菌和厚EPS的保护下，AnAOB生活在棕褐色颗粒内。有趣的是，一些聚集物粘附在固体载体表明产生生物膜，这是AnAOB避开DO、低温等恶劣环境胁迫的另一种方式。

  厌氧氨氧化颗粒沉淀物的实际应用中有极大几率会出现AnAOB抑制，这是由于负荷率降低或过度曝气导致溶解氧浓度相比来说较高。将AnAOB置于严格保护之下是明智的选择。在预颗粒化阶段，絮凝活性沉淀物对AnAOB以厌氧氨氧化聚集体的形式进行初始富集起着及其重要的作用。絮凝活性沉淀物不仅消耗高DO，还能通过EPS分泌促进AnAOB的聚集。从长远来看，絮凝活性颗粒与厌氧氨氧化颗粒沉淀物的共存有利于AnAOB的发展。另一方面，当处理单元经常面临高DO浓度的压力时，连续补料方式是富集AnAOB较好的选择。对SBR而言，加入载体或活性沉淀物是抵抗高DO浓度胁迫的有效途径。此外，维持生物量的增长对水温季节性下降的稳定厌氧氨氧化系统很重要。为维持SBR中的生物量，应该延长沉降时间。

  以低浓度氨氮废水为研究对象，在温度降低、无严格厌氧条件下，在CFR和SBR条件下启动并运行厌氧氨氧化颗粒沉淀。与SBR相比，CFR的性能更好（0.33 kg N m

  ），当水温出现季节性下降（18-14℃）时，CFR的性能更好（0.33 kg N m

  ）。在预颗粒化阶段，絮凝活性沉淀物对AnAOB起着保护者的作用，以抵御氧气等有毒物质。不同操作导致厌氧氨氧化颗粒化方法不一样。基于CFR提供的稳定和适宜的环境，AnAOB可以很容易自聚集并分泌EPS，EPS可以捕获其他细菌作为守护者。在SBR中，AnAOB在其他细菌和厚EPS的保护下生活在棕黄色颗粒内，其他聚集物粘附在固体载体表明产生生物膜。

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